云南省西双版纳美洲钩虫耐药β

[目 的]钩虫病是以人体感染美洲钩虫、十二指肠钩虫为主引起的肠道寄生虫病,其中以美洲钩虫感染最为常见,其发病率和致残率相对较高,是严重危害我国人民身体健康的重要公共卫生问题之一。苯并咪唑类药物是最常用的三类驱虫药之一,现研究提示耐药性的产生是由美洲钩虫β-tubulin基因编码的3个单核苷酸多态性(SNP)造成的,且耐药性的产生主要与两个位点198、200的突变(E198A和F200Y)有关,但国内在此方面的研究相对匮乏。因此本研究旨在了解云南西双版纳地区美洲钩虫对苯并咪唑类药物的耐药性,及其美洲钩虫β-tubulin基因耐药性相关单核苷酸多态性情况,为该地区钩虫病诊疗防治提供理论基础和新策略。[方 法](1)对样本虫卵ITS-2基因的PCR扩增鉴定:按不同的海拔区域、不同的民族聚居地,分别收集西双版纳州景洪市嘎洒镇曼典村(傣族坝区寨子)、景洪市基诺山乡新司土村(基诺族低山区寨子)、勐海县勐往乡糯东村(布朗族中山区寨子)常住人口的粪便样本。用改良加藤厚涂片法对所有粪便样本进行“一粪三检”,通过镜检确定感染寄生虫类型并对各种虫卵分别进行计数,筛选出钩虫卵密度较高的阳性样本保存于4℃冰箱。根据美洲钩虫的ITS-2基因设计特异性扩增引物,采用常规PCR方法对样本虫卵DNA进行扩增并测序,经Blast 比对确定钩虫种类。(2)美洲钩虫β-tubulin基因的PCR扩增与耐药相关位点的单核苷酸多态性分析:在通过合成针对美洲钩虫核糖体第二内转录间隔区(ITS-2)基因鉴定为美洲钩虫的基础上,采用半巢式PCR方法扩增西双版纳地区收集并鉴定的美洲钩虫β-tubulin基因,送克隆测序,并对测序结果进行分析,重点对耐药性相关的198、200两个位点的单核苷酸多态性进行分析。[结 果](1)3个地区镜检钩虫卵阳性样本共77份,其中勐海县勐往乡糯东村39份;景洪市基诺山乡新司土村32份;景洪市嘎洒镇曼典村6份。用常规PCR方法对77份样本虫卵DNA进行扩增,产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后观察结果,有74份样本均扩增出大小约190bp的特异性目的条带。测序后通过Blast比对,结果样本虫卵基因序列与美洲钩虫的ITS-2序列有高度的相似性,均在99.47%-100%,即鉴定为美洲钩虫。经半巢式PCR方法对72份已鉴定为美洲钩虫的β-tubulin基因进行扩增,结果有60份样本均扩增出大小约315bp的特异性目的条带。测序后重点分析了西双版纳地区美洲钩虫耐药相关的2个单核苷酸多态性(SNP)位点,结果表明在检测的60份西双版纳美洲钩虫β-tubulin基因序列中,198和200位点处均无耐药性碱基突变,未发现有单核苷酸多态性情况,共检测到一种基因型,即纯合敏感型(Hs-198,Hs-200),占总数的100%,为优势基因型。(2)新发现37份样本在美洲钩虫β-tubulin基因第251位密码子处存在同义突变,发生了单个碱基的转换,缬氨酸(GTG→GTA,由G转换成A),但未引起编码氨基酸的改变。(3)本研究中经过反复的探索与试验,建立并优化了样本虫卵ITS-2基因与美洲钩虫β-tubulin基因在PCR扩增过程中的反应体系、反应程序。(4)系统进化表明:西双版纳地区的美洲钩虫种群ITS-2基因与多哥、伊朗、澳大利亚及我国南宁地区的美洲钩虫种群ITS-2基因间亲缘关系最近;与澳大利亚外群的ITS-2基因之间有很高的亲缘关系。西双版纳地区的美洲钩虫种群β-tubulin基因与美国地区同种群间的亲缘关系最近,与美国地区外群β-tubulin基因间的亲缘关系较近。[结 论]西双版纳地区的美洲钩虫种群β-tubulin基因中暂未检测到198、200位点处存在苯并咪唑类药物耐药性相关的单核苷酸多态性,共检测到一种基因型,即纯合敏感型(Hs-198,Hs-200),为当地美洲钩虫优势基因型。发现在β-tubulin基因第251位密码子处存在同义突变。西双版纳地区的美洲钩虫种群ITS-2基因与多哥、伊朗、澳大利亚及我国南宁地区间的种群亲缘关系最近,置信度为91%;与美国地区的外群有明显的分支,表明两者之间的亲缘关系相差较大。西双版纳地区的美洲钩虫种群β-tubulin基因与美国地区同种群间的亲缘关系较近,置信度为93%;与墨西哥、荷兰、英国地区的外群有明显的分支,表明种群之间的亲缘关系较远。