PLCG2突变通过促进小胶质细胞抗原呈递能力降低AD风险

小胶质细胞与阿尔茨海默病（AD）的发生和发展密切相关。TREM2的一个重要下游成员PLCG2磷脂酶主要由脑中的小胶质细胞表达，是一个重要的小胶质细胞相关AD风险基因。其中目前已知的一个PLCG2的突变形式P552R与晚期AD的发病风险降低紧密相关。然而，PLCG2-P522R对人体内小胶质细胞功能的影响以及该变体降低AD风险的机制在很大程度上仍不清楚。近期美国加州大学的研究团队在《Alzheimer‘sDementia》期刊发表了题为“TheP522RprotectivevariantofPLCG2promotestheexpressionofantigenpresentationgenesbyhumanmicrogliainanAlzheimer'sdiseasemousemodel”的研究论文。作者团队通过移植PLCG2-P522R人类诱导多能干细胞小胶质细胞获得嵌合型AD小鼠，在7个月龄时进行了单细胞和批量RNA测序及了组学分析。研究结果发现PLCG2-P522R变体诱导小胶质细胞的人类白细胞抗原（HLA）表达显著增加，并诱导了抗原呈递、趋化因子信号和T细胞增殖途径以及CD8+T细胞向大脑的募集。研究人员认为PLCG2-P522R变体增加了小胶质细胞招募T细胞和呈递抗原的能力，促进了小胶质细胞的转录状态，从而降低了AD发病风险。

由于PLCG2信号位于TREM2下游，而TREM2对疾病相关性小胶质细胞（DAMs）的形成至关重要，所以作者团队首先检测了P522R变体对斑块相关的DAM亚群的影响。检测结果显示P522R变体的xMGs（异种移植的人类iPSC衍生的小胶质细胞）显著增加了HLA-DR蛋白的表达。但是P522RxMGs和WTxMGs在纤维淀粉样斑块10μm内的xMGs数量和斑块总面积方面没有观测到差异（图1A-F）。另外与WTxMGs相比，P522RxMGs在DAM特异性标志物CD9（图1G-K）和人类特异性APOE的检测中都没看到明显的差异。并且斑块周围LAMP1免疫阳性萎缩神经元的数量也没有变化。而在WT嵌合小鼠中P522RxMGs也显示出相似的增加了HLA-DR免疫原性的趋势。整体而言这些结果表明PLCG2-P522R变体通过斑块相关的xMGs增加HLA-DR的表达，但同时又不影响小胶质细胞与斑块的接近程度。

图1P522R异种移植人诱导的多能干细胞衍生的小胶质细胞（XMGs）在斑块周围表现出人白细胞抗原（HLA）-DR蛋白水平增加

作者团队接下来从移植7个月后的嵌合小鼠脑组织中分离出xMGs进行了10XscRNA-seq检测。通过数据分析揭示总共产生了六个xMGs集群，每个集群都代表一类独特的小胶质细胞状态（图2A-C）。为了进一步确定P522R突变是否会诱发这些集群的转变，作者团队接下来对检测结果进行了差异比例分析（DPA）。结果显示P522R小鼠体内稳态小胶质细胞显著减少（P=0.011），同时伴随表达细胞因子的小胶质细胞增加（P=0.001），以及干扰素反应性小胶质细胞也表现出增加的趋势（P=0.08；图2D）。有意思的是作者团队还观察到每个集群簇中许多基因表达的显著增加，包括细胞因子和趋化因子基因（CCL2、CCL3、CCL8、CXCL10、IL1B；图2E）和几个DAM基因（MAFB、SPP1和FABP5；图2F）。并且与组织学结果一致的是作者团队并没有观察到CD9和APOEmRNA的显著增加。而属于HLA基因复合体的多个基因（包括HLA-DPB1，HLA-A，HLA-DRA，CD74和HLA-DPA1）在多个小胶质细胞集群簇中都有明显的增加（图2G）。除此之外一些干扰素基因（包括IFI27、IFITM3、LY6E、IFIT3和MX1）的表达也明显增加了（图2H）。作者团队进一步通过伪时间分析发现，P522RxMGs通过干扰素反应途径促进人类小胶质细胞对淀粉样蛋白反应的进程，而WTxMGs则通过MHCII类的中间状态向DAM特征表型发展（图2I）。

了更深入的了解PLCG2-P522R突变所改变的生物学途径，作者团队从额外的AD嵌合小鼠中分离出WT和P522RxMGs进行了批量RNA测序。通过比较移植的PLCG2-P522R或PLCG2-WTxMGs的AD小鼠样本的热图显示，P522RxMGs中的基因（包括CCL8、一系列HLA基因和CIITA）显著上调（图3A）。而其中CIITA（Ⅱ类反式激活因子）是编码MHCⅠ类和Ⅱ类蛋白复合体的HLA基因表达的主要调节者。作者团队对这些上调基因进行的基因本体论分析显示，MHCⅡ类抗原呈递是一个主要信号，同时还有细胞因子/趋化因子信号、干扰素信号和T细胞增殖的调节。进一步通过分子功能的基因本体分析也强调了MHCⅡ类蛋白结合和抗基因结合的增加（图3B-C）。另外，作者团队对分离自WT嵌合小鼠的小胶质细胞的批量RNA测序也显示，即使在没有淀粉样病变的情况下HLA基因也有类似的P522R依赖性的增加，表明P522R突变可能促使小胶质细胞采用MHCII类状态。总体而言，作者团队从嵌合AD小鼠分离的xMGs的批量RNA测序证实并扩展了其scRNA-seq的发现，进一步证实了P522RxMGs参与抗原呈递信号通路以及促使其中相关基因的表达增加。另外作者团队对照了人类AD样本的研究数据，发现许多富集在P522RxMGs中的基因与人类AD患者中大幅减少的一类小胶质细胞亚型中的基因重叠，都是以MHCII类抗原呈递相关基因的表达为特征（图3D）。这一结果进一步表明了P522R变体促使抗原呈递基因表达可能在AD发病进程中起到重要的作用。

为了进一步研究P522RxMGs是否会诱发AD斑块的病理学改变，作者团队接下来对纤维淀粉样蛋白（Amylo-Glo）的表征进行详细分析。作者首先进行了xMGs的海马内单侧移植并没有发现其向对侧海马区域的迁移，并且也没有发现两侧海马区域内斑块总数的明显变化。进一步对移植了P522R和WTxMGs的小鼠的斑块负荷分析后，作者也没有发现该保护性变体对小鼠皮层和海马中吞噬淀粉样蛋白周围的xMGs总数、小胶质细胞淀粉样蛋白内化总量以及斑块数量、大小或总斑块负荷的明显影响（图4A-J）。此外作者团队也没有观察到嵌合AD小鼠的小胶质细胞形态和GFAP+星形胶质细胞数量的显著变化。

在上述对AD嵌合小鼠的组织学分析和xMGs的RNA测序分析都表明P522R突变增强了先天免疫和获得性免疫之间的相互作用。然而作者团队开始时为了允许人类xMGs植入小鼠脑内使用了遗传免疫缺陷的（RAG2-/-，IL2Rγ-/-）小鼠模型，从而排除了该模型中对T细胞的检测。为了弥补这一缺陷作者团队进一步对免疫完整的PLCG2-P522RKI5X小鼠脑组织中P522R小胶质细胞与T细胞之间可能的相互作用进行了检测。组织学分析结果显示与PLCG2-WT5X小鼠相比，PLCG2-P522RKI小鼠的CD8+T细胞数量显著增加，但CD4+T细胞数量并没有明显变化，并且T细胞也更容易在靠近小胶质细胞的位置被观察到（图5A-H）。基于以上这些结果，作者团队认为保护性的P522R-PLCG2变体显著增加了CD8+T细胞向大脑的招募，并可能通过增加MHCⅡ类基因的表达来增加小胶质细胞与CD4+T细胞之间的相互作用。

图5免疫功能正常的P522RKI5X小鼠显示CD8+T细胞向背侧小室募集增加

作者团队在嵌合AD小鼠中关于AD保护性PLCG2-P522R变体的研究数据揭示了有更多的P522R-xMGs在细胞因子簇中发挥功能，包括参与招募T细胞的趋化因子表达增加，以及对抗原呈递至关重要的多个HLA基因的表达增加，暗示了AD中小胶质细胞和T细胞之间串扰的重要性。在P522RKI5XFAD小鼠中显示CD8+T细胞向脑内的募集增加进一步证实了这一推断。尽管这些变化是如何降低AD风险的目前尚不清楚，但是作者团队的发现强烈暗示小胶质细胞与T细胞的串扰增加为P522R变体的保护性质的解释提供了一条线索。总之，作者研究团队的实验结果为进一步确定小胶质细胞和T细胞相互作用调节AD进展的精确机制提供了重要的参考，并可能在未来具有重要的临床价值。

文章来源：小崔和他的小伙伴们